2.1. Клеточная теория, ее основные положения, роль в формировании современной естественнонаучной картины мира. Развитие знаний о клетке. Клеточное строение организмов, сходство строения клеток всех организмов – основа единства органического мира, доказательства родства

3.9. Биотехнология, клеточная и генная инженерия, клонирование. Роль клеточной теории в становлении и развитии биотехнологии. Значение биотехнологии для развития селекции, сельского хозяйства, микробиологической промышленности, сохранения генофонда планеты. Этические

ГЛАВА ЧЕТВЁРТАЯ. МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ Когда мы добудем знания о всех биологических процессах от макроскопических до молекулярных, то смерть, болезни, немощь, бессилие, старение и физическая неполноценность больше не будут являться неотъемлемой частью

Двадцать первый век часто называют веком биологии, имея в виду, что прикладное значение открытий, сделанных за последние десятилетия в биологии, и, в первую очередь, в таких науках как генетика и молекулярная биология. Последние, в свою очередь, являются теоретической основой для таких прикладных дисциплин как генная и клеточная инженерия.
Генная инженерия, или технология рекомбинантных ДНК - это изменение с помощью биохимических и генетических методик хромосомного материала - основного наследственного вещества клеток. Известно, что хромосомный материал состоит из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Биологи изолируют те или иные участки ДНК, соединяют их в новых комбинациях и переносят из одной клетки в другую. В результате удается осуществить такие изменения генома, которые естественным путем вряд ли могли бы возникнуть. Фактически генная инженерия занимается тем, что берет гены и части ДНК одного вида, например, рыбы, и пересаживает их в клетки другого, на- мер, помидора. Для этого генная инженерия располагает набором различных технологий для того, чтобы разрезать ДНК произвольно или в определенных участках гена. Выделив сегмент ДНК, можно его изучать, размножать или склеивать с ДНК других клеток и организмов. Генная инженерия позволяет преодолеть межвидовые барьеры и перемешивать информацию между абсолютно не связанными между собой видами.
В настоящее время научились уже переносить гены от одного животного к другому и от животного к растениям. Получены "трансгенные" мыши, свиньи, овцы, коровы и рыбы. ДНК можно прямо инъецировать в оплодотворенное яйцо вида- еципиента, или можно использовать в качестве переносчика вирус, который, проникнув в клетку, внесет с собой и нужный ген. Третий метод связан с использованием неспециализированных стволовых (т.е. родоначальных) клеток эмбриона. Гены вводят в стволовые клетки путем инъекции или с помощью вируса, и полученные в результате трансгенные клетки инъецируют другому зародышу, который включает эти чужие клетки в свои ткани. Гены человека вводили и в растения, например в табак, в надежде получить таким способом большие количества нужных белков, в частности антител и ферментов. В этих экспериментах перенос генов оказался довольно простым делом. Была придумана специальная "генная пушка", выстреливающая ДНК прямо в листья растений.
Практическое применение генной инженерии. Современные технологии позволяют синтезировать гены, и с помощью таких синтезированных генов, введенных в бакте- , получают ряд весьма важных биологических веществ. Их производство составило важную отрасль биотехнологии.
Методом генной инженерии уже получен уже ряд препаратов, в том числе инсулин человека и противовирусный препарат интерферон. И хотя эта технология еще только разрабатывается, она сулит достижение огромных успехов и в медицине, и в сельском хозяйстве. В медицине, например, это весьма перспективный путь создания и производства вакцин. В сельском хозяйстве с помощью рекомбинантной ДНК могут быть получены сорта культурных растений, устойчивые к засухе, холоду, болезням, насекомымвредителям и гербицидам.
Интерферон - белок, синтезируемый организмом в ответ на вирусную инфекцию, изучают сейчас как возможное средство лечения рака и СПИДа. Понадобились бы тысячи литров крови человека, чтобы получить такое количество интерферона, какое дает всего один литр бактериальной культуры. Ясно, что выигрыш от массового производства этого вещества очень велик. Очень важную роль играет также получаемый на основе микробиологического синтеза инсулин, необходимый для лечения диабета. Методами генной инженерии удалось создать и ряд вакцин, которые испытываются сейчас для проверки их эффективности против вызывающего СПИД вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). С помощью рекомбинантной ДНК получают в достаточных количествах и человеческий гормон роста, единственное средство лечения редкой детской болезни - гипофизарной карликовости.
Еще одно перспективное направление в медицине, связанное с рекомбинантной ДНК, - т.н. генная терапия. В этих работах, которые пока еще не вышли из экспериментальной стадии, в организм для борьбы с опухолью вводится сконструированная по методу генной инженерии копия гена, кодирующего мощный противоопухолевый фермент. Генную терапию начали применять также для борьбы с наследственными нарушениями в иммунной системе.
В сельском хозяйстве удалось генетически изменить десятки продовольственных и кормовых культур. В животноводстве использование гормона роста, полученного биотехнологическим путем, позволило повысить удои молока; с помощью генетически измененного вируса создана вакцина против герпеса у свиней.
Генная терапия. В последнее десятилетие в биомедицинскую практику вошло понятие генной терапии. Под генной терапией понимается комплекс методов, позволяющих вводить "лечебные" гены в клетки живого организма для компенсации существующих и профилактики возможных патологических процессов.
В настоящее время проводятся широкие клинические испытания генотерапевтических подходов в лечении таких заболеваний, как рак, иммунодефицит и др. Эту деятельность следует приветствовать и поддерживать, чтобы, если вы, к несчастью, не имеете "хороших" генов от рождения, в один прекрасный день смогли бы купить их в ближайшей аптеке .
Но есть и оборотная сторона медали. Несмотря на явную пользу от генетических исследований и экспериментов, само понятие "генная инженерия" породило различные подозрения и страхи, стало предметом озабоченности и даже политических споров. Мно- гие опасаются, например, что какойнибудь вирус, вызывающий рак у человека, будет введен в бактерию, обычно живущую в теле или на коже человека, и тогда эта бактерия будет вызывать рак. Возможно также, что фрагмент ДНК, несущий ген устойчивости к лекарственным препаратам, введут в пневмококк, в результате чего пневмококк станет устойчивым к антибиотикам и пневмония не будет поддаваться лечению. Такого рода опасности, несомненно, существуют.
В современной генной терапии в ряде случаев в качестве векторов для доставки генов используются модифицированные вирусы, которые в естественных условиях в ходе инфекции используют клетки организма для саморепликации, что в итоге приводит к раз- ушению зараженных клеток и высвобождению миллионов копий исходного вируса.

наверх

В естественных условиях борьбу с вирусами осуществляет система иммунитета, которая узнает зараженные клетки и уничтожает их еще до образования вирусного потомства. В генной терапии вирусы модифицируются таким образом, что они теряют способность к размножению в клетках организма. В их геноме исключается некоторый участок, существенный для репликации вируса. Вместо него вставляется "лечебный" ген. Такой вирус способен проникать в клетки и обеспечивать экспрессию гена, ответственно- го за терапевтический эффект, при этом не происходит размножения вируса и, следовательно, разрушения клетки. Тем не менее, иммунная система воспринимает такие клетки как чужеродные и уничтожает их. С этим связана одна из основных проблем современной генотерапии, так как для устойчивого терапевтического действия введенного гена необходима его длительная экспрессия. Поэтому усилия многих научных лабораторий направлены на преодоление этого иммунного барьера. С этой целью в геном вируса вводятся дополнительные гены, продукты которых обладают иммуносупрессивным, т.е. подавляющим иммунитет действием. Придание иммуносупрессивных свойств вирусным векторам также важно в генной терапии аутоиммунных заболеваний, в частности такого, как ревматоидный артрит.
Опасности генной терапии связаны с попаданием таких модифицированных вирусов в природную среду. При этом существует вероятность обмена генетической информации с вирусом дикого типа, что приведет к образованию нового вируса, способного разрушать клетки организма - вируса, который остается "невидимым" для иммунной системы. Если представить, что такой вирус будет передаваться воздушнокапельным путем, а симптомы будут проявляться только через период времени, в течение которого невозможно осуществлять тотальный карантин (например, один месяц), то последствия для человечества и биосферы могут стать катастрофическими.
Генетические исследования ведутся серьезными и ответственными учеными, а методы, позволяющие свести к минимуму возможность случайного распространения потенциально опасных микробов, все время совершенствуются. Оценивая возможные опасности, которые эти исследования в себе таят, следует сопоставлять их с подлинными трагедиями, вызванными недоеданием и болезнями, губящими и калечащими людей.

наверх

Евгеника

Развитие генетики привело к рождению "евгеники" - учения о средствах, путях и условиях изменения наследственности человека и создания более совершенных его ка- еств.
Понятие "евгеника" ввел в 1883 г. пионер математической статистики Фрэнсис Гальтон (18221911), применив идею отбора своего кузена Чарльза Дарвина к человеку. "Евгеника есть наука, которая занимается всеми влияниями, улучшающими качества расы", - сал он в книге "Исследования человеческой способности и ее развития", - говорил о расах животных, растений, особенно человека. Надо оговориться, что наукой евгеника все же не стала: она была движением, в том смысле, как мы говорим о зеленом или феминистическом движении, - ногда с сильным и качественным научным моментом В Британии евгеника дала основу математической генетике популяций, в России - основу генетике человека и медицинской генетике и косвенно экспериментальной генетике популяций. На основе положений евгеники в ряде стран, например, во Франции, проводились мероприятия, направленные на охрану материнства и детства. В то же время, именно "евгенисты" дали рациональное обоснование "акту Джонсона" - систскому закону США 1924 г. об ограничении иммиграции из Европы "низших рас", особенно цыган и ев- еев.
Следует отметить русское евгеническое движения, существовавшего в 19201930 гг. Обсуждение возможностей евгеники, совпавшее по времени со стартом и быст- ым развитием генетических исследований в России, шло в рамках мощных традиций русской медицины и биологии. Возглавлявшие движение видные российские биологи Ю.А. Филипченко (18821930) и Н.К. Кольцов (18721940) обладали достаточным влиянием для поддержания в этом движении высоких научных стандартов и этических норм. Ев- геническая программа Филипченко, включавшая изучение наследственности человека путем анкетных обследований, генетическое и евгеническое просвещение, подачу советов евгенического характера. В контексте сегодняшних представлений она должна быть определена как медико- генетическая программа.
Н.К.Кольцов широко понимал евгенику и включал в нее составление генеалогий, географию болезней, витальную статистику, социальную гигиену и ряд социологических тем, но прежде всего - нициированные и руководимые им исследования генетики психи- еских особенностей человека, типов наследования цвета глаз и волос, биохимических показателей крови и групп крови, роли наследственности в развитии эндемического зоба, обследование монозиготных близнецов. В евгенических докладах и статьях Кольцов постоянно подчеркивал роль биологического разнообразия и желательность разветвленных открытых полииерархических систем, биологических и социальных. Поэтому то, чем он занимался, говоря о евгенике, нельзя назвать собственно евгеникой (в указанном вы- е смысле). Напротив, у нас есть все основания утверждать, что Кольцов выдвинул программу исследований в области генетики человека.
В наши дни, в контексте проекта изучения генома человека и техники генной инженерии, позитивная евгеника получила иной смысл: предполагаемая (в будущем) пересадка генов ради повышения физических и умственных способностей, теперь уже любого человека. Отношение к перспективам новой позитивной евгеники стало одной из трех основных тем обсуждения на генетической части Симпозиума по социальным и этическим последствиям проекта "Геном человека" в Национальном институте здоровья США в 1991 г. Следует помнить о том, что осуществление подобных технологий пока весьма проблематично, так как механизмы включения генов у человека остаются загадкой. Известно, что сдвиг по одному наследственному признаку влечет за собой изменение широкого спектра коррелированных, т.е. связанных с ним признаков .
Таким образом, следует различать естественнонаучную основу евгеники, т.е. законы генетики и философскосоциологическую надстройку. Эта надстройка может быть как гуманистической, так и реакционной, антигуманной, обслуживающей идеи фашизма, расизма.

наверх

Клонирование

Проблема клонирования животных по своей сенсационности и социальной значимости стоит в настоящее время в центре внимания не только специалистов в области биологии, но и широкой общественности и постоянно освещается в средствах массовой информации. При этом чаще всего приходится встречаться как с неоправданным оптимизмом, так и с крайним пессимизмом и неприятием исследований в этой области. Как отмечает ряд авторов, и то и другое, в первую очередь обусловлено некомпетентностью лиц, представляющих в СМИ соответствующую информацию.
Прежде всего надо определить, что следует понимать под клонированием животных и что такое клон. По принятому в науке определению клонирование является точным воспроизведением того или иного живого объекта в какомто количестве копий. Эти копии и называются клоном. Вполне естественно, что все эти "копии" должны обладать идентичной наследственной информацией, т.е. нести идентичный набор генов. В ряде случаев получение клона животных не вызывает особого удивления и является рутинной процедурой, хотя и не такой уж простой. Генетики получают подобные клоны, когда используемые ими объекты размножаются посредством партеногенеза, т.е. бесполым путем, без предшествующего оплодотворения. Естественно, те особи, которые будут развиваться из потомков той или иной исходной половой клетки, будут в генетическом отношении одинаковыми и могут составить клон. У нас в стране, например, блестящие работы по клонированию такого рода выполняет на шелкопряде с помощью разработанной им специальной методики академик В.А. Струнников. Выведенные им клоны шелкопряда славятся на весь мир. В то же время ему удалось установить, что отдельные особи в пределах определенного клона не идентичны, но отличаются друг от друга, и порою весьма существенно. В ряде клонов это разнообразие бывает большим, чем в генетически разнообразных популяциях.
В эмбриологии тоже известны методы получения клонов. Если зародыша морского ежа на стадии раннего дробления искусственно разделить на составляющие его клетки - бластомеры, то из каждого разовьется целый организм. В ходе последующего развития зародышевые клетки теряют эту замечательную способность и становятся все более и более специализированными. Можно также использовать ядра так называемых стволовых эмбриональных клеток от какогонибудь конкретного раннего эмбриона, которые еще не являются очень специализированными (таковым будет их потомство). Эти ядра пересаживают в яйцеклетки, из которых удалено собственное ядро, и такие яйцеклетки, развиваясь в новые организмы, опятьтаки могут образовать клон генетически идентичных животных.
У человека известны случаи своеобразного "естественного" клонирования - это так называемые однояйцевые близнецы, которые возникают благодаря редко встречающемуся естественному разделению оплодотворенной яйцеклетки на два отделяющихся друг от друга и в последующем самостоятельно развивающихся бластомера. Такие близнецы (их принято называть монозиготными) очень похожи друг на друга, но не идентичны, т.е. точными копиями друг друга не являются!

Возникновение генетической (генной) инженерии связано с созданием технологии выделения генов из ДНК и методики размножения нужного гена естествоиспытателем П. Бергом (1972 г., США). Внедрение в живой организм чужеродной генетической информации, генетическое манипулирование с целью изменения существующих и создания новых генотипов составляют одну из самых перспективных актуальных задач генной инженерии.

На основе генной инженерии возникла новая отрасль фармацевтической промышленности, представляющая собой перспективную ветвь современной биотехнологии – микробиологический синтез. С помощью методов генной инженерии получены клоны многих генов, инсулин, гистоны, коллаген и глобин мыши, кролика и человека, пептидные гормоны и интерферон, которые используют в лечебной практике.

Развитие генной инженерии делает возможным создание новых генотипов сельскохозяйственных растений и животных, для которых характерно отсутствие определенных болезней и увеличение продуктивности.

Методы генной инженерии широко применяются в медицине, фармакологии, микробиологии. Например, с помощью молекулярных проб (фрагментов ДНК) можно определить зараженность донорской крови вирусом СПИДа.

Разработаны генные технологии улучшения вакцин и создания новых вакцин. Генетики ведут исследования по генетической модификации свойств микроорганизмов, необходимых для сыроварения, виноделия, хлебопечения, производства кисломолочных продуктов.

В сельском хозяйстве используют модифицированные микробы для борьбы с вредными вирусами, микробами и насекомыми.

Клеточная инженерия занимается генетическими манипуляциями с отдельными клетками или группами клеток. К достижениям клеточной инженерии можно отнести методику оплодотворения в пробирке яйцеклетки с последующей имплантацией ее зародышей в матку. В настоящее время в мире насчитывается десятки тысяч «детей из пробирок».

Методы клеточной инженерии применяются в животноводстве при выведении животных с определенными, полезными для человека качествами. В данном случае в яйцеклетки подопытных животных внедряют участки молекул ДНК, изменяя генотип особи.

В растениеводстве с целью уменьшить сроки размножения и значительно увеличить число новых экземпляров используют клональное микроразмножение (получение растительного организма из одной клетки).

Однако необходимо отметить и негативный аспект развития генной и клеточной инженерии: становится реальной возможность получения новых патогенных вирусов и создания новых видов бактериологического оружия, что не только ведет к дестабилизации и напряженности отношений между странами, но и ставит под угрозу благополучие человеческой цивилизации.

В 1997 г. в печати появилась информация о том, что шотландский ученый Я. Вильмут разработал методику клонирования млекопитающих, в результате чего появилась клонированная овечка Долли. Было проведено 236 опытов, из которых только один оказался успешным – родилась овца, несущая весь генотип матери.

После этого все чаще стали возникать дискуссии по проблеме клонирования человека. Действительно, технологии генной инженерии приближаются к решению этой задачи. Но следует помнить, что клонирование человека вызовет целый ряд этических, юридических и религиозных проблем, среди которых наиболее острыми будут, вероятно, следующие:

♦ подрыв нравственных ценностей человечества;

♦ неблагоприятное влияние на социальную и биологическую устойчивость человеческой популяции;

♦ возможное зарождение цивилизации с иными нравственными критериями (или их отсутствием);

♦ появление криминальных объединений исследователей, использующих достижения генной инженерии в противоправных целях.

Таким образом, нравственные и социальные аспекты использования достижений генетики в интересах человека требуют широкого обсуждения, внимания и общественного контроля.

Вопросы для самопроверки

1. Почему электромагнетизм является атрибутом существования живой материи?

2. Что означает эволюционно-синергетический подход в описании природы?

3. В чем сущность самоорганизации в природе в целом и в живой материи в частности?

4. Какова роль синергетики для современного миропонимания?

5. Назовите основные свойства самоорганизующихся систем.

6. Дайте понятие бифуркационного дерева как модели эволюции природы, человека, общества.

7. Дайте определение жизни с точек зрения различных ученых. Назовите отличия живой материи от неживой.

8. Охарактеризуйте структурные уровни организации живой материи.

9. Сформулируйте основные гипотезы происхождения жизни на Земле.

10. Назовите основные этапы происхождения жизни по А. И. Опарину.

11. Охарактеризуйте клетку как элементарную единицу живого.

12. Назовите основные положения эволюционной теории Ч. Дарвина. Чем отличается синтетическая теория эволюции от дарвинской?

13. Что такое эволюционная картина мира и глобальный эволюционизм?

14. Дайте определения наследственности и изменчивости.

15. Что определяют понятия «наследование», «ген», «геном», «генофонд»?

16. Что представляют собой генотип и фенотип? Почему принято считать, что генотип определяет фенотип?

17. Дайте определение генетического кода и перечислите его свойства.

18. Перечислите основные принципы гибридологического анализа.

19. Какие признаки называются доминантными, а какие – рецессивными?

20. Какие организмы называются гомозиготными, а какие – гетерозиготными?

21. Дайте современную формулировку законов Менделя.

22. В чем состоят особенности генетики человека? Перечислите основные методы генетики человека.

МБОУ «Ивановская СОШ»

Конспект урока по теме: « Генная и клеточная инженерия»

Учитель биологии

Краснящих Л.И.

Тема урока: «Генная и клеточная инженерия»

Цели урока:

Познакомиться с регуляцией процессов биосинтеза белка, с достижениями генной, клеточной инженерии, клонированием.

Формирование критического подхода к фактам и событиям.

Определения.

Генная инженерия – это искусственный перенос нужных генов от одного вида живых организмов (бактерий, животных, растений) в другой вид, часто очень отдаленный по происхождению.

Генно-модифицированный организм (ГМО) - организм, полученный с применением методов генной инженерии и содержащий гены, их фрагменты или комбинации генов других организмов.

Трансгенные организмы - животные, растения, микроорганизмы, вирусы, геном которых изменен.

Что такое ГМО

Это растения, в которые встраивают чужеродные гены с целью развития устойчивости к гербицидам и пестицидам, увеличения сопротивляемости к

вредителям, повышенияих урожайности.

ГМП в России

С 1999 года в нашу страну начали активно завозить

генетически модифицированные продукты,

модифицированных культур составляют ввозимые из-за

рубежа соя, кукуруза и картофель. Они могут попадать

на наши столы и в "чистом виде" - импортированные

свежие овощи, картофельные чипсы и полуфабрикаты,

и в виде добавок в мясных, рыбных, кондитерских и

других изделиях. В России с 1.09. 2002 г. ввели

обязательную маркировку пищевых продуктов,

полученных из трансгенных растений. На этикетках

должна быть надпись:

«Содержит генетически модифицированный источник (ГМИ)».

Генетически модифицированные продукты

Вредны они или нет?

Почему НЕТ

«Мы поедаем мясо коров,

но коровами не становимся»

В процессе пищеварения

продукты разлагаются на

неспецифичные составляющие.

Почему ДА

«Генетически модифицированные продукты могут содержать медленные яды»

Химеры на продажу

После употребления ГМО организм становится устойчивым к определенным антибиотикам. Это обстоятельство теоретически

грозит ситуацией бесполезного приёма лекарственных препаратов.

После эксперимента над крысами наибольшее беспокойство вызвал тот факт, что у крыс уменьшился объем мозга, после употребления

модифицированной сои.

Чем опасны ГМО для организма человека?

ГМО влияют на формулу крови,наносят вред печени и почкам,

развивают невосприимчивость к антибиотикам, увеличивают риск

возникновения опасных аллергий, вызывают пищевые отравления,

мутации.

Генная инженерия в медицине

Получение человеческого инсулина в промышленных масштабах;

Разработка интерферона.

Около 200 новых диагностических препаратов (не белковых, а генных) уже введены в медицинскую практику,

Более 100 генно-инженерных лекарственных веществ находится на стадии клинического изучения.

Клеточная инженерия

Большой вклад в биологию клетки вносят методы клеточной инженерии.

Клеточная инженерия – область биотехнологии, основанная на культивировании клеток и тканей на питательных средах.

Клеточная инженерия тесно связанна с генной инженерией.

Культура тканей

Выращивание из отдельных клеток культур тканей (например, женьшеня), которые продуцируют лекарственные вещества, как и целое растение.

Гибридизация клеток различных видов растений

Сливаются клетки растений, относящихся к разным видам, например, картофеля и томата. Это путь к созданию новых видов растений.

Создание гибридом

Гибридизация животных клеток.

Гибридомы, полученные в результате объединения лимфоцитов и раковых клеток, вырабатывают антитела, как лимфоциты, и бессмертны, как раковые клетки. Интерферон, который получают с помощью гибридом, применяется для лечения заболеваний.

Метод пересадки ядер соматических клеток в яйцеклетки.

Путь для клонирования животных.

Вывод: Клеточная инженерия вносит большой вклад в развитие медицины и сельского хозяйства!!!

Клонирование

КЛОНИРОВАНИЕ - воспроизведение генетически однородных организмов путём бесполого размножения. При клонировании исходный организм служит родоначальником клона – ряда организмов, повторяющих из поколения в поколение и генотип , и все признаки родоначальника. Таким образом, сущность клонирования заключается в повторении одной и той же генетической информации.

Яйцеклетка

Клетка тела

Ядра клеток удаляются

Ядро клетки тела внедряется в яйцеклетку

Клонированная клетка становится эмбрионом

Стволовые клетки, полученные из эмбрионов.

Клонирование растений

У растения берут какую-нибудь ткань, например, кусочек корнеплода моркови, помещают в колбу или пробирку с плотной питательной средой, добавляют гормоны роста. Через некоторое время клетки теряют признаки прежней дифференцировки и приступают к размножению. В это время клетки можно рассадить по одной штуке в множество колб или пробирок, и процесс пойдет с прежним темпом в каждой из них. Образуется клеточная масса (каллус), в которой далее идет формирование органов: корня, стебля, листьев и в конце концов цветков. Растение в пробирке готово.

Ценность метода клонирования растений заключается в том, что таким образом удается вырастить стерильный, не пораженный вирусами или бактериями, посадочный материал.

Клонирование животных (схема)

Клонирование человека.

а) Репродуктивное б) Терапевтическое

Репродуктивное клонирование человека - предполагает что , родившийся в результате клонирования, получает , словом - ведёт такую же жизнь, как и все «обычные» люди. Репродуктивное клонирование встречается со множеством , проблем, которые сегодня ещё не имеют очевидного решения. В большинстве приведёт к его переходу в . Однако в некоторых странах терапевтическое клонирование разрешено, например, в .

Схема

Картинка: Невозмутимый строй во всем,

Созвучье полное в природе, -

Лишь в нашей призрачной свободе

Разлад мы с нею сознаем.

Ф. Тютчев.

Этично ли проводить генетические эксперименты на человеке?

Этичны ли эксперименты над животными?

Не будут ли нас окружать подобные уродцы?

Домашнее задание § 16, небольшое рассуждение на тему:

«Этичность применения генных и клеточных технологий».

Генная и клеточная инженерия. Опасность современных биотехнологий

1. Генная и клеточная инженерия. Опасность современных биотехнологий

Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А. А.). По Э. С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

·специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

·быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

·конструирование рекомбинантной ДНК;

·гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;

·клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

·введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

История генетической инженерии. Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.

На рубеже 50 - 60-х годов 20 века были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E. coli, ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.

Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа. Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.

Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.

Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-рецепиента) генов эукариот, главным образом, животных.

Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С. Коэн, Х. Бой¬ер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.

Получение генномодифицированных (трансгенных) сортов растений и продуктов питания

Введение генов в растительные клетки. Ввести чужеродную ДНК в растения можно различными способами. Для двудольных растений существует естественный вектор для горизонтального переноса генов: плазмиды агробактерий. Что касается однодольных, то, хотя в последние годы достигнуты определенные успехи в их трансформации агробактериальными векторами, все же подобный путь трансформации встречает существенные затруднения. Наиболее продуктивным и чаще всего используемым является метод бомбардировки микрочастицами. При достаточной скорости эти частицы могут непосредственно проникать в ядро, что сильно повышает эффективность трансформации. Этим же методом можно, впрочем, трансформировать и другие ДНК-содержащие клеточные органеллы - хлоропласты и митохондрии.

В последнее время был разработан и успешно применен также комбинированный метод трансформации, названный агролистическим. При этом чужеродная ДНК вводится в ткани каким-либо физическим методом, например, баллистическим. Вводимая ДНК включает как Т-ДНК вектор с целевым и маркерным геном, так и агробактериальные гены вирулентности, поставленные под эукариотический промотор. Временная экспрессия генов вирулентности в растительной клетке приводит к синтезу белков, которые правильно вырезают Т-ДНК из плазмиды и встраивают ее в хозяйский геном, как и при обычной агробактериальной трансформации.

После проведения тем или иным способом трансформации растительной ткани ее помещают in vitro на специальную среду с фитогормонами, способствующую размножению клеток. Среда обычно содержит селективный агент, в отношении которого трансгенные, но не контрольные клетки приобретают устойчивость. Регенерация чаще всего проходит через стадию каллуса, после чего при правильном подборе сред начинается органогенез (побегообразование). Сформированные побеги переносят на среду укоренения, часто также содержащую селективный агент для более строгого отбора трансгенных особей.

Достижения генной инженерии растений. Первые трансгенные растения (растения табака со встроенными генами из микроорганизмов) были получены в 1983 г. Первые успешные полевые испытания трансгенных растений (устойчивые к вирусной инфекции растения табака) были проведены в США уже в 1986 г.

После прохождения всех необходимых тестов на токсичность, аллергенность, мутагенность и т.д. первые трансгенные продукты появились в продаже в США в 1994 г. Это были томаты Flavr Savr с замедленным созреванием, созданные фирмой "Calgen", а также гербицид-устойчивая соя компании "Monsanto". Уже через 1-2 года биотехнологические фирмы поставили на рынок целый ряд генетически измененных растений: томатов, кукурузы, картофеля, табака, сои, рапса, кабачков, редиса, хлопчатника.

В настоящее время получением и испытанием генетически модифицированных растений занимаются сотни коммерческих фирм во всем мире с совокупным капиталом более ста миллиардов долларов. В 1999 г. трансгенные растения были высажены на общей площади порядка 40 млн. га, что превышает размеры такой страны, как Великобритания. В США генетически модифицированные растения (GM Crops) составляют сейчас около 50% посевов кукурузы и сои и более 30-40% посевов хлопчатника. Это говорит о том, что генно-инженерная биотехнология растений уже стала важной отраслью производства продовольствия и других полезных продуктов, привлекающей значительные людские ресурсы и финансовые потоки. В ближайшие годы ожидается дальнейшее быстрое увеличение площадей, занятых трансгенными формами культурных растений.

Первая волна трансгенных растений, допущенных для практического применения, содержала дополнительные гены устойчивости (к болезням, гербицидам, вредителям, порче при хранении, стрессам).

Нынешний этап развития генетической инженерии растений получил название "метаболическая инженерия". При этом ставится задача не столько улучшить те или иные имеющиеся качества растения, как при традиционной селекции, сколько научить растение производить совершенно новые соединения, используемые в медицине, химическом производстве и других областях. Этими соединениями могут быть, например, особые жирные кислоты, полезные белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, модифицированные полисахариды, съедобные вакцины, антитела, интерфероны и другие "лекарственные" белки, новые полимеры, не засоряющие окружающую среду и многое, многое другое. Использование трансгенных растений позволяет наладить масштабное и дешевое производство таких веществ и тем самым сделать их более доступными для широкого потребления.

Запасные белки основных культурных видов кодируются семейством близкородственных генов. Накопление запасных белков семян - сложный биосинтетический процесс. Первая генноинженерная попытка улучшения свойства одного растения путем введения гена запасного белка от другого была, проведена Д. Кемпом и Т. Холлом в 1983 г. в США. Ген фазеолина бобов с помощью Ti-плазмиды был перенесен в геном подсолнечника. Результатом этого опыта было лишь химерное растение, получившее название санбин. В клетках подсолнечника были обнаружены иммунологически родственные фазеолиновые полипептиды, что подтверждало факт переноса гена между растениями, относящимися к различным семействам

Более реальной задачей для генетической инженерии считается улучшение аминокислотного состава белков.

Растения могут производить и белки животного происхождения. Так, встраивание в геном растений Arabidopsis thaliana и Brassica napus химерного гена, состоящего из части гена запасного 25-белка арабидопсиса и кодирующей части для нейропептида - энкефалина, приводило к синтезу химерного белка до 200 нг на 1 г семени. Два структурных белковых домена были связаны последовательностью, узнаваемой трипсином, что давало возможность в дальнейшем легко изолировать чистый энкефалин.

В другом эксперименте удалось после скрещивания трансгенных растений, в одном из которых был встроен ген гамма-субъединицы, а во втором - ген каппа-субъединицы иммуноглобулина, получить у потомства экспрессию обеих цепей. В результате растение формировало антитела, составляющие до 1,3% суммарного белка листьев. Также было показано, что в растениях табака могут собираться полностью функциональные секреторные моноклональные иммуноглобулины. Предполагается, что на основе таких моноклональных антител, продуцируемых трансгенными растениями, удастся создать действительно антикариесную зубную пасту. Из других белков животного происхождения, которые представляют интерес для медицины, показана продукция в растениях человеческого β-интерферона.

Разработаны также подходы, позволяющие получать бактериальные антигены в растениях и использовать их в качестве вакцин. Получен картофель, экспрессирующий олигомеры нетоксичной субъединицы β-токсина холеры. Эти трансгенные растения могут быть использованы для получения дешевой вакцины от холеры.

Жиры. Важнейшим сырьем для получения разного рода химических веществ являются жирные кислоты - основной компонент растительного масла. По своей структуре это углеродные цепи, которые обладают различными физико-химическими свойствами в зависимости от своей длины и степени насыщения углеродных связей. В 1995 году была закончена экспериментальная проверка и получено разрешение от федеральных властей США на выращивание и коммерческое использование трансгенных растений рапса с измененным составом растительного масла, включающего вместе с обычными 16- и 18-членными жирными кислотами также и до 45% 12-членной жирной кислоты - лаурата. Это вещество широко используется для производства стиральных порошков, шампуней, косметики.

Полисахариды. Проводится работа по созданию трансгенных растений картофеля и других крахмалнакапливающих культур, в которых это вещество будет находиться в основном в виде амилопектина, то есть разветвленной форме крахмала, или же в основном только в виде амилозы, то есть линейных форм крахмала. Раствор амилопектина в воде более жидкий и прозрачный, чем у амилозы, которая при взаимодействии с водой образует ригидный гель. Так, например, крахмал, состоящий в основном из амилопектина, по-видимому, будет иметь спрос на рынке производителей различных питательных смесей, где сейчас в качестве наполнителя используется модифицированный крахмал. Генетической модификации могут подвергаться также геномы пластид и митохондрий. Такие системы позволяют значительно увеличить содержание продукта в трансгенном материале.

Создание гербицидоустойчивых растений. В новых, интенсивных сельскохозяйственных технологиях гербициды применяются очень широко. Это связано с тем. что на смену прежним экологически опасным гербицидам широкого спектра действия, обладающим токсичностью для млекопитающих и длительно сохраняющимся во внешней среде, приходят новые, более совершенные и безопасные соединения. Однако они обладают недостатком - подавляют рост не только сорняков, но и культурных растений. Такие высокоэффективные гербициды, как, глифосат, атразины интенсивно изучаются на предмет выявления механизма толерантности к ним некоторых сорняков. Так, на полях, где широко используют атразин, довольно часто появляются атразинустойчивые биотипы у многих видов растении.

Изучение механизма устойчивости к гербицидам с целью получения методами генетической инженерии культурных растений, обладающих этим признаком, включает следующие этапы: выявление биохимических мишеней действия гербицидов в растительной клетке: отбор устойчивых к данному гербициду организмов в качестве источников генов устойчивости: клонирование этих генов: введение их в культурные растения и изучение их функционирования

Существуют четыре принципиально различных механизма, которые могут обеспечивать устойчивость к тем или иным химическим соединениям, включая гербициды: транспортный, элиминирующий, регуляционный и контактный. Транспортный механизм устойчивости заключается в невозможности проникновения гербицида в клетку. При действии элиминирующего механизма устойчивости вещества, попавшие внутрь клетки, могут разрушаться с помощью индуцируемых клеточных факторов, чаще всего деградирующих ферментов, а также подвергаться тому или иному виду модификации, образуя неактивные безвредные для клетки продукты. При регуляционной резистентности белок или фермент клетки, инактивирующийся под действием гербицида, начинает усиленно синтезироваться, ликвидируя таким образом дефицит нужного метаболита в клетке. Контактный механизм устойчивости обеспечивается изменением структуры мишени (белок или фермент), взаимодействием с которым связано повреждающее действие гербицида

Установлено, что признак гербицидоустойчивости является моногенным, то есть признак детерминируется чаще всего одним-единственным геном. Это очень облегчает возможность использования технологии рекомбинантной ДНК для передачи этого признака. Гены, кодирующие те или иные ферменты деструкции и модификации гербицидов, могут быть с успехом использованы для создания гербицидоустойчивых растении методами генетической инженерии.

Традиционные методы селекции создания сортов, устойчивых к гербицидам, очень, длительны и малорезультативны. Наиболее широко применяемый за рубежом гербицид глифосат (коммерческое название Roundup) подавляет синтез важнейших ароматических аминокислот, воздействуя на фермент 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазу (ЕПШФ-синтаза). Известные случаи устойчивости к этому гербициду связаны либо с повышением уровня синтеза этого фермента (регуляционный механизм), либо с возникновением мутантного фермента, нечувствительного к глифосфату (контактный механизм). Из устойчивых к глифосфату растений был выделен ген ЕПШФ-синтазы и поставлен под промотор вируса мозаики цветной капусты. С помощью Ti-плазмиды эта генетическая конструкция была введена в клетки петунии. При наличии одной копии гена в регенерированных из трансформированных клеток растениях синтезировалось фермента в 20 - 40 раз больше, чем в исходных растениях, но устойчивость к глифосфату увеличилась только в 10 раз.

К числу наиболее распространенных гербицидов, используемых при обработке зерновых культур, относится атразин. Он подавляет фотосинтез, связываясь с одним из белков фотосистемы II и прекращая транспорт электронов. Устойчивость к гербициду возникает в результате точечных мутаций в этом пластохинон связывающем белке (замена серина на глицин), вследствие чего он теряет способность взаимодействовать с гербицидом. В ряде случаев удалось осуществить перенос гена мутантного белка в чувствительные к атразину растения с помощью Ti-плазмиды. Интегрированный в хромосому растений ген устойчивости был снабжен сигнальной последовательностью, которая обеспечивала транспорт синтезируемого белка в хлоропласты. Химерные растения проявляли значительную устойчивость к таким концентрациям атразина, которые вызывали гибель контрольных растений с геном белка дикого типа. Некоторые растения способны инактивировать атразин путем отщепления остатка хлора ферментом глутатион-S-трансфераза. Этот же фермент инактивирует и другие родственные гербициды триазинового ряда (пропазин, симазин и др.).

Существуют растения, естественная устойчивость которых к гербицидам основана на детоксикации. Так, устойчивость растений к хлорсульфурону может быть связана с дезактивацией молекулы гербицида путем его гидроксилирования и последующего гликозилирования введенной гидроксильной группы. Создание растений, устойчивых к патогенам и вредителям Устойчивость растений к тем или иным патогенам чаще всего является сложным мультигенным признаком.

Одновременная передача нескольких локусов трудна даже методами генной инженерии, не говоря о классических методах селекции. Более простым является другой путь. Известно, что у устойчивых растений при атаке патогенов изменяется метаболизм. Накапливаются такие соединения, как Н2О2, салициловая кислота, фитоаллексины. Повышенный уровень этих соединений способствует противостоянию растения в борьбе с патогенами.

Вот один из примеров, доказывающий роль салициловой кислоты в иммунном ответе растений. Трансгенные растения табака, которые содержат бактериальный ген, контролирующий синтез салицилат гидролазы (этот фермент разрушает салициловую кислоту), были неспособны к иммунному ответу. Поэтому изменение генно-инженерным путем уровня салициловой кислоты или выработки в растениях в ответ на патоген Н2О2 может быть перспективным для создания устойчивых трансгенных растений.

В фитовирусологии широко известен феномен индуцированной перекрестной устойчивости растений к вирусным инфекциям. Сущность этого явления состоит в том, что заражение растения одним штаммом вируса предотвращает последующую инфекцию этих растений другим вирусным штаммом. Молекулярный механизм подавления вирусной инфекции пока неясен. Показано, что для иммунизации растений достаточно введения отдельных вирусных генов, например генов капсидных белков. Так, ген белка оболочки вируса табачной мозаики перенесли в клетки табака и получили трансгенные растения, у которых 0,1% всех белков листьев был представлен вирусным белком. Значительная часть этих растений при инфицировании вирусом не проявляла никаких симптомов заболевания. Возможно, что синтезирующийся в клетках белок оболочки вируса мешает вирусной РНК нормально функционировать и формировать полноценные вирусные частицы. Установлено, что экспрессия капсидного белка вируса табачной мозаики, вируса мозаики люцерны, вируса огуречной мозаики, Х-вируса картофеля в соответствующих трансгенных растениях (табак, томаты, картофель, огурцы, перцы) обеспечивает высокий уровень их защиты от последующей вирусной инфекции. Причем у трансформированных растений не отмечалось снижения фертильности, нежелательного изменения ростовых и физиологических характеристик исходных экземпляров и их потомства. Полагают, что индуцированная устойчивость растений к вирусам обусловлена особым антивирусным белком, очень похожим на интерферон животных. Представляется возможным методом генетической инженерии усилить экспрессию гена, кодирующего этот белок, путем его амплификации или подстановки под более сильный промотор.

Следует отметить, что использование генетической инженерии для защиты растений от различных патогенных микроорганизмов в значительной мере сдерживается недостаточностью знаний о механизмах защитных реакций растений. Для борьбы с насекомыми-вредителями в растениеводстве используются химические средства - инсектициды. Однако они оказывают вредное влияние на млекопитающих, убивают и полезных насекомых, загрязняют окружающую среду, дороги, и кроме того, насекомые довольно скоро приспосабливаются к ним. Известно более 400 видов насекомых, устойчивых к используемым инсектицидам. Поэтому все большее внимание привлекают биологические средства борьбы, обеспечивающие строгую избирательность действия и отсутствие адаптации вредителей к применяемому биопестициду.

Уже довольно давно известна бактерия Bacillus thuringiensis, продуцирующая белок, являющийся очень токсичным для многих видов насекомых, в то же время безопасный для млекопитающих. Белок (дельта-эндотоксин, CRY-белок) продуцируется различными штаммами В. thuringiensis. Взаимодействие токсина с рецепторами строго специфично, что усложняет подбор комбинации токсин-насекомое. В природе найдено большое количество штаммов В. thuringiensis, чьи токсины действуют только на определенные виды насекомых. Препараты В. thuringiensis в течение десятилетий использовали для контроля насекомых на полях. Безопасность токсина и его составных белков для человека и других млекопитающих полностью доказана. Встраивание гена этого белка в геном растений дает возможность получить трансгенные растения, не поедаемые насекомыми.

Кроме видоспецифичности по действию на насекомых встраивание прокариотических генов дельта-токсинов в геном растений даже под контролем сильных эукариотических промоторов не привело к высокому уровню экспрессии. Предположительно такое явление возникло в связи с тем, что эти бактериальные гены содержат значительно больше адениновых и тиминовых нуклеотидных оснований, чем растительная ДНК. Эта проблема была решена путем создания модифицированных генов, где из природного гена вырезали и добавляли те или иные фрагменты с сохранением доменов, кодирующих активные части дельта-токсина. Так, например, с помощью таких подходов был получен картофель, устойчивый к колорадскому жуку. Получены трансгенные растения табака, способные синтезировать токсин. Такие растения были нечувствительны к гусеницам Manduca sexta. Последние погибали в течение 3 суток контакта с токсинпродуцирующими растениями. Токсинообразование и обусловленная им устойчивость к насекомым передавалась по наследству как доминантный признак.

В настоящее время так называемые Bt-растения (от В. thuringiensis) хлопка и кукурузы занимают основную долю в общем объеме генетически модифицированных растений этих культур, которые выращивают на полях США.

В связи с возможностями генной инженерии конструировать энтомопатогенные растения на основе токсина микробного происхождения еще больший интерес к себе вызывают токсины растительного происхождения. Фитотоксины являются ингибиторами белкового синтеза и осуществляют защитную функцию, направленную против насекомых-вредителей микроорганизмов и вирусов. Лучше всех среди них изучен рицин, синтезируемый в клещевине: его ген клонирован и установлена нуклеотидная последовательность. Однако высокая токсичность рицина для млекопитающих ограничивает генноинженерные работы с ним только техническими культурами, не используемыми в пищу человека и на корм животным. Токсин, вырабатываемый фитолаккой американской, эффективен против вирусов и безвреден для животных. Механизм его действия заключается в инактивации собственных рибосом при проникновении в клетки различного рода патогенов, в том числе фитовирусов. Пораженные клетки некротизируются, предотвращая размножение патогена и его распространение по растению. В настоящее время проводятся исследования по изучению гена этого белка и передаче его в другие растения.

Вирусные болезни широко распространены среди насекомых, поэтому для борьбы с насекомыми-вредителями можно использовать природные вирусы насекомых, препараты которых называют вирусными пестицидами. В отличие от ядохимикатов они обладают узким спектром действия, не убивают полезных насекомых, они быстро разрушаются во внешней среде и не опасны для растений и животных. Наряду с вирусами насекомых используются как биопестициды некоторые грибы, поражающие насекомых-вредителей. Применяемые сейчас биопестициды являются природными штаммами энтомопатогенных вирусов и грибов, однако не исключена возможность создания в будущем методами генетической инженерии новых эффективных биопестицидов.

Повышение устойчивости растений к стрессовым условиям. Растения очень часто подвергаются воздействию различных неблагоприятных факторов окружающей среды: высокие и низкие температуры, недостаток влаги, засоление почв и загазованность среды, недостаток или, напротив, избыток некоторых минеральных веществ и т. д. Этих факторов множество, поэтому и способы защиты от них многообразны - от физиологических свойств до структурных приспособлений, позволяющих преодолевать их пагубное действие.

Устойчивость растений к тому или иному стрессовому фактору является результатом воздействия множества разных генов, поэтому говорить о полной передаче признаков толерантности от одного вида растения другому генноинженерными методами не приходится. Тем не менее у генетической инженерии имеются определенные возможности для повышения устойчивости растений. Это касается работы с отдельными генами, контролирующими метаболические ответы растений на стрессовые условия, например сверхпродукцию пролина в ответ на осмотический шок, на действие засоления, синтез особых белков в ответ на тепловой шок и т. д. Дальнейшее углубленное изучение физиологической, биохимической и генетической основы ответной реакции растения на условия среды, несомненно, позволит применять методы генетической инженерии для конструирования устойчивых растений.

Пока можно отметить лишь косвенный подход для получения морозоустойчивых растений, основанный на генноинженерных манипуляциях с Pseudomonas syringae. Этот микроорганизм, сосуществующий с растениями, способствует их повреждению ранними заморозками Механизм явления связан с тем, что клетки микроорганизма синтезируют особый белок, локализующийся во внешней мембране и являющийся центром кристаллизации льда. Известно, что формирование льда в воде зависит от веществ, могущих служить центрами образования льда. Белок, вызывающий формирование кристаллов льда в различных частях растения (листья, стебли, корни), является одним из главных факторов, ответственных за повреждение тканей растений, чувствительных к ранним заморозкам. Многочисленные эксперименты в строго контролируемых условиях показали, что стерильные растения не повреждались заморозками вплоть до -6-8° С, тогда как у растений, имеющих соответствующую микрофлору, повреждения возникали уже при температурах -1,5-2° С. Мутанты этих бактерий, потерявшие способность синтезировать белок, вызывающий формирование кристаллов льда, не повышали температуру образования льда, и растения с такой микрофлорой были устойчивы к заморозкам. Штамм таких бактерий, распыленный над клубнями картофеля, конкурировал с обычными бактериями, что приводило к повышению морозоустойчивости растений. Возможно, такие бактерии, созданные с помощью методов генной инженерии и используемые в качестве компонента внешней среды, будут служить для борьбы с заморозками.

Повышение эффективности биологической азотфиксации. Хорошо изучен фермент ответственный за восстановление молекулярного азота до аммония. - нитрогеназа. Структура нитрогеназы одинакова у всех азотфиксирующих организмов. При фиксации азота непременным физиологическим условием является защита нитрогеназы от разрушения под действием кислорода. Лучше всех среди азотфиксаторов изучены ризобии, образующие симбиоз с бобовыми растениями, и свободноживущая бактерия Klebsiella pneumoniae. Установлено, что у этих бактерий за фиксацию азота ответственно 17 генов - так называемых nif-генов. Все эти гены сцеплены друг с другом и расположены в хромосоме между генами ферментов биосинтеза гистидина и генами, определяющими усвоение шикимовой кислоты. У быстрорастущей ризобии nif-гены существуют в форме мегаплазмиды, содержащей 200-300 тысяч пар нуклеотидов.

Среди генов азотфиксации выявлены гены, контролирующие структуру нитрогеназы, белковый фактор, принимающий участие в транспорте электронов, регуляторные гены. Регуляция генов азотфиксации довольно сложна, поэтому генноинженерный перенос азотфиксирующей функции от бактерий непосредственно высшим растениям в настоящее время уже не обсуждается. Как показали эксперименты, даже в самом простом эукариотическом организме - дрожжах не удалось добиться экспрессии nif-генов, хотя они и сохранялись в течение 50 генераций.

Эти опыты показали, что диазотрофность (азот-фиксация) свойственна исключительно прокариотическим организмам, и nif-гены не смогли преодолеть барьер, разделяющий прокариоты и эукариоты, из-за слишком сложной своей структуры и регуляции генами, расположенными вне nif-области. Возможно, более удачным окажется перенос nif-генов с помощью Ti-плазмид в хлоропласты, поскольку механизмы экспрессии генов в хлоропластах и в клетках прокариот близки. В любом случае нитрогеназа должна быть защищена от ингибирующего действия кислорода. Кроме того, фиксация атмосферного азота - очень энергоемкий процесс. Вряд ли растение под влиянием nif-генов может так кардинально изменить свой метаболизм, чтобы создать все эти условия. Хотя не исключено, что в будущем методами генетической инженерии можно будет создать более экономно работающий нитрогеназный комплекс.

Более реально использование генноинженерных методов для решения следующих задач: повышение способности ризобии колонизировать бобовые растения, повышение эффективности фиксации и ассимиляции азота путем воздействия на генетический механизм, создание новых азотфиксирующих микроорганизмов путем введения в них nif-генов, передача способности к симбиозу от бобовых растений к другим.

Первостепенной задачей генетической инженерии для повышения эффективности биологической фиксации азота является создание штаммов ризобии с усиленной азотфиксацией и колонизирующей способностью. Колонизация бобовых растений ризобиями протекает очень медленно, лишь единичные из них дают начало клубенькам. Это происходит потому, что местом инвазии ризобии является только одна небольшая область между точкой роста корня и ближайшим к ней корневым волоском, находящимся на стадии формирования. Все остальные части корня и развившиеся корневые волоски растения нечувствительны к колонизации. В ряде случаев сформировавшиеся клубеньки оказываются неспособными фиксировать азот, что зависит от многих растительных генов (выявлено не менее пяти), в частности от неблагоприятного сочетания двух рецессивных генов.

Традиционными методами генетики и селекции удалось получить лабораторные штаммы ризобий с более высокой колонизирующей способностью. Но они в полевых условиях испытывают конкуренцию со стороны местных штаммов. Повышение их конкурентоспособности, видимо, можно осуществить генноинженерными методами. Повышение эффективности процесса азотфиксации возможно применением генноинженерных приемов, основанных на увеличении копий гена, усилении транскрипции тех генов, продукты которых образуют «узкое» место в каскадном механизме азотфиксации, путем введения более сильных промоторов и т. п. Важно повышение коэффициента полезного действия самой нитрогеназной системы, осуществляющей непосредственное восстановление молекулярного азота в аммиак.

Повышение эффективности фотосинтеза. С4-растения характеризуются высокими темпами роста и скоростью фотосинтеза, у них практически отсутствует видимое фотодыхание. У большинства сельскохозяйственных культур, относящихся к С3-растениям, высокая интенсивность фотодыхания. Фотосинтез и фотодыхание - тесно связанные процессы, в основе которых лежит бифункциональная активность одного и того же ключевого фермента - рибулозобисфосфат-карбоксилазы (РуБФК). РуБФ-карбоксилаза может присоединять не только С02, но и 02, то есть осуществляет реакции карбоксилирования и оксигенирования. При оксигенировании РуБФ образуется фосфогликолат, который служит основным субстратом фотодыхания - процесса выброса С02 на свету, в результате чего теряется часть фотосинтетических продуктов. Низкое фотодыхание у С4-растений объясняется не отсутствием ферментов гликолатного пути, а ограничением оксигеназной реакции, а также реассимиляцией С02 фотодыхания.

Одной из задач, стоящих перед генетической инженерией, является исследование возможности создания РуБФК с преобладающей карбоксилазной активностью.

Получение растений с новыми свойствами. В последние годы ученые используют новый подход для получения трансгенных растений с "antisense RNA" (перевернутой или антисмысловой РНК), который позволяет управлять работой интересуемого гена. В этом случае при конструировании вектора копию ДНК (к-ДНК) встраиваемого гена переворачивают на 180°. В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула мРНК и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРНК образует с ней комплекс и закодированный белок не синтезируется.

Такой подход использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. Вектор включал к-ДНК гена PG, контролирующего синтез полигалактуроназы - фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена PG синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена в трансгенах позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям.

Такой же подход можно применить для регулирования сроков созревания томатов, а в качестве мишени в этом случае используют ген EFE (ethylene-forming enzyme), продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена. Этилен - это газообразный гормон, одной из функций которого является контроль за процессом созревания плодов. тратегия антисмысловых конструкций широко применима для модификации экспрессии генов. Эта стратегия используется не только для получения растений с новыми качествами, но и для фундаментальных исследований в генетике растений. Следует упомянуть еще об одном направлении в генной инженерии растений, которое до недавнего времени в основном использовали в фундаментальных исследованиях - для изучения роли гормонов в развитии растений. Суть экспериментов заключалась в получении трансгенных растений с комбинацией определенных бактериальных гормональных генов, например только iaaM или ipt т.д. Эти эксперименты внесли существенный вклад в доказательство роли ауксинов и цитокининов в дифференцировке растений.

В последние годы этот подход стали использовать в практической селекции. Оказалось, что плоды трансгенных растений с геном iaaM, находящимся под промотором гена Def (ген, который экспрессируется только в плодах), являются партенокарпическими, то есть сформировавшимися без опыления. Партенокарпические плоды характеризуются либо полным отсутствием семян, либо очень небольшим их количеством, что позволяет решить проблему "лишних косточек", например в арбузе, цитрусовых и т.д. Уже получены трансгенные растения кабачков, которые в целом не отличаются от контрольных, но практически не содержат семян.

Обезоруженную, лишенную онкогенов Ti-плазмиду ученые активно используют для получения мутаций. Этот метод носит название Т-ДНК-инсерционного мутагенеза. Т-ДНК, встраиваясь в геном растения, выключает ген, в который она встроилась, а по утрате функции можно легко отбирать мутанты (явление сайлесинга - замолкания генов). Этот метод замечателен также тем, что позволяет сразу обнаружить и клонировать соответствующий ген. В настоящее время таким способом получено множество новых мутаций растений и соответствующие гены клонированы. М.А. Раменской на основе Т-ДНК мутагенеза получены растения томатов с неспецифической устойчивостью к фитофторозу. Не менее интересен и другой аспект работ - получены трансгенные растения с измененными декоративными свойствами. Один из примеров - это получение растений петунии с разноцветными цветками. На очереди голубые розы с геном, контролирующим синтез голубого пигмента, клонированным из дельфиниума.

Проблемы биобезопасности трансгенных растений

Одним из главных возражений против употребления "трансгенных" продуктов питания является наличие во многих из них генов устойчивости к антибиотику (в частности, к канамицину), которые содержались в исходной конструкции ДНК в качестве селективных.

Предполагается, что эти гены устойчивости могут при переваривании пищи передаваться эндогенной микрофлоре, в том числе патогенной, в результате чего микробы могут приобрести резистентность к данному антибиотику. Однако в реальности вероятность такого события ничтожно мала - многочисленные эксперименты и наблюдения в природе относительно подобного горизонтального переноса генов до сих пор давали только отрицательные результаты.

Что касается возможной токсичности или аллергенности трансгенных растений, то здесь применяют те же жесткие стандарты, как и для полученных традиционным путем новых сортов культурных растений или новых видов продуктов питания. Никаких особых отличий трансгенных растений от обычных по этим параметрам ожидать не приходится (разве что в лучшую сторону при блокировании синтеза токсинов или аллергенов), да и действительно, как правило, не наблюдается на практике.

Тем не менее, и в этом случае, чтобы отвести любые возражения от трансгенных растений, пробуют, например, вводить в растения не один, а сразу несколько генов устойчивости к разным гербицидам. Передача нескольких генов сорнякам гораздо менее вероятна, чем одного гена. Кроме того, мультигербицидная устойчивость позволит чередовать разные гербициды при обработке посевов, что не даст возможности для распространения какого-либо определенного гена устойчивости в сорняках.

Предлагается также вводить гены устойчивости не в ядерный, а в хлоропластный геном. Это может предотвратить нежелательный дрейф генов с помощью пыльцы, так как хлоропласты наследуются только по материнской линии.

Еще один генно-инженерный путь борьбы с сорняками без использования генов резистентности к гербицидам вообще - биотрансгенный. Речь идет об использовании мелких животных, например, кроликов, для поедания сорняков на полях. При этом, чтобы оградить от поедания культурные растения, в них можно ввести какой-либо ген, делающий их непривлекательными (запах, вкус) для данного животного. Такой биотрансгенный подход сразу снял бы большинство выдвигаемых сейчас возражений против трансгенных культур.

Близкие по сути экологические возражения касаются трансгенных растений со встроенными "инсектицидными" генами, способных, как считают, спровоцировать у насекомых-вредителей возникновение массовой резистентности. Здесь также предложены действенные способы для уменьшения этой опасности, например, использование генов нескольких разных токсинов и/или индуцибельных промоторов, быстро активирующихся при нападении насекомых на растение. Данная проблема в общем не нова, так как многие из инсектицидов, используемых сейчас на "генном уровне", давно применяют в виде чистого вещества для опрыскивания посевов.

Еще одно нежелательное следствие использования трансгенных растений с генами инсектицидов заключается в том, что пыльца этих растений может быть токсичной и для полезных насекомых, которые данной пыльцой питаются. Некоторые экспериментальные данные говорят о том. что такая опасность действительно существует, хотя о ее возможных масштабах говорить пока трудно. Однако и здесь уже предложены и испытаны адекватные генно-инженерные решения, например, использование трансгеноза через хлоропластную ДНК, или промоторов, не работающих в пыльце.

Введение генов в клетки млекопитающих

Манипуляции с клетками млекопитающих можно разделить на 2 большие группы: эксперименты с соматическим клетками и эксперименты по трансформации половых клеток. В последнем случае конечный результат - получение трансгенных организмом.

Генетическая транформация соматических клеток млекопитающих. Культуры трансформированных клеток млекопитающих используют для получения различных веществ. Хотя культуры клеток животных, особенно при массовом выращивании, гораздо менее экономичны, чем бактериальные дрожжевые культуры, они обладают существенным преимуществом - способностью осуществлять мелкие, но весьма важные модификации белков - продуктов гена млекопитающих. Например, для эффективного функционирования ряда белков необходимо присоединение к ним цепочек из молекул углеводов или липидов. Образование и присоединение таких цепочек - обычный процесс для клеток млекопитающих, тогда как бактериальная клетка не способна производить подобные модификации.

Помимо создания клеток-продуцентов, трансформация соматических клеток млекопитающих позволяет изучать тонкие механизмы регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки животных, а при необходимости и человека, что имеет огромное значение для медицинской генетики.

Культуры клеток млекопитающих могут оказаться эффективным источником выделения некоторых вирусных антигенов с целью получения вакцин для животных и человека. Получение таких вакцинных культур клеток осуществимо при помощи техники рекомбинантных ДНК и эффективных векторов экспрессии для клеток млекопитающих и человека. При использовании ДНК-вакцин в организм вводится не антиген, а ген, кодирующий синтез этого антигена. Ген встраивается в плазмиду, а плазмида вводится организм путем обыкновенной инъекции.

ДНК-вакцины имеют хорошие перспективы в животноводстве. Достоинством таких вакцин является очень маленький объем - для иммунизации одной мыши достаточно 10-50 мкг плазмиды, одной коровы - 200-300 мкг. Плазмида сохраняется в организме до 1 года. В стадии клинических испытаний в настоящее время находятся ДНК-вакцины против микоплазм, возбудителя туберкулеза, сальмонеллеза, лейшманиоза.

Развитие злокачественной опухоли в организме обычно подавляет иммунитет. Проблема в том, чтобы подхлестнуть иммунную систему в целом и направить ее действие против раковых клеток. Исследователи из Медицинской школы в Энн-Арборе (Мичиган) придумали метод борьбы с раком. В опухолевые клетки толстой кишки подопытных мышей ввели гены, кодирующие белки другой линии мышей. Это можно осуществить с помощью липосом или вируса. После появления на внешней стороне клеточной мембраны этих белков иммунная система атаковала такие клетки. 20% больных мышей выздоровели, у 70% опухоль уменьшилась, в контрольной группе все умерли. Лимфоциты боролись не только с «меченными» клетками опухоли, но и клетками метастаз, следовательно, иммунная система «проснулась». В настоящее время ведутся эксперименты на людях с раком кожи.

Генотерапия

Лечение заболеваний с помощью генов получило название генотерапии. Сейчас в мире насчитывается порядка 400 проектов, посвященных лечению с помощью генотеропии.

Успешная коррекция генетических дефектов у таких животных и отсутствие нежелательных побочных эффектов генной терапии являются важнейшей предпосылкой для разрешения клинических испытаний.

Существует два типа генотерапии: заместительная и корректирующая. Заместительная генотерапия заключается во вводе в клетку неповрежденного гена. Внесенная копия заменит по функциям сохранившийся в геноме больного дефектный ген. Все проводимые сегодня клинические испытания используют внесение в клетку дополнительных количеств ДНК. При корректирующей терапии предполагается замена дефектного гена нормальным в результате рекомбинации. Пока этот метод на стадии лабораторных испытаний, так как эффективность его еще очень низка.

В зависимости от способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная терапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная терапия или терапия ex vivo предполагает выделение и культивирование специфических типов клеток пациента, введение в них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реинфузию их тому же пациенту.

Примером может служить лечение комбинированного иммунодефииицита. Комбинированный иммунодефицит может быть результатом дефекта гена аденозиндезаминазы. Впервые попытка лечения такого больного методами генотерапии была предпринята в США в 1990 г. У больного ребенка извлекли Т-лимфоциты, трансформировали ретровирусным вектором, введя нормальный ген аденозиндезаминазы и вернули клетки в организм. Введение приходится повторять. Более эффективна аналогичная трансформация стволовых клеток костного мозга.

Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного. В настоящее время не существует общедоступного метода культивирования клеток легких, поэтому при легочных заболеваниях единственный способ доставить чужеродный ген - это ввести его прямо в организм. Муковисцидоз - весьма распространенное среди людей белой расы тяжелое наследственное заболевание легких, которое поражает, например, в семьях из Центральной Европы одного новорожденного из 2500 и для которого установлен дефектный ген, кодирующий белок-регулятор трансмембранной проводимости. Основное проявление дефектного гена - пневмония. Поражаются все эпителиальные клетки. Основная проблема - как доставить ген в клетки, покрытые слизью, которая препятствует трансформации. Неповрежденную копию "гена заболевания", включенную в аденовирусный вектор или липосому, вводят в форме аэрозоля в дыхательные пути больного.

Для коррекции нарушения при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна (заболевании мальчиков, связанном с дефектами Х-хромосомы) нормальный ген, кодирующий белок дистрофии, пытались прямо вкалывать в мышечные волокна, используя либо "голую" ДНК, либо аденовирусный вектор. Другие исследователи трансплантировали больному миобласты после генетической коррекции. Ранее неподвижный ребенок приобретал способность двигаться! К сожалению, во всех этих опытах удается получить только временный терапевтический эффект, и процедура введения гена должна неоднократно повторяться.

Список наследственных заболеваний, которые пытаются или планируют лечить генами, велик. Это и ревматоидный артрит, и фенилкетонурия, и заболевания, связанные с недостатком гормонов (инсулина, эритропоэтина, гормона роста). В случае хронической анемии, связанной с дефицитом эритропоэтина, на основании опытов на животных предлагается принципиально новый подход к лечению. Так как каждая из наших клеток содержит один и тот же геном, можно заставить фибробласты кожи, которые в норме не производят эритропоэтина, синтезировать этот гормон. Для этого нужно ввести в геном новую контролирующую область и тем самым снять запрет со считывания (экспрессии) гена эритропоэтина, присутствующего, но "молчащего" в фибробластах.

Практически в любой области медицины либо начаты клинические испытания лечения наследственных заболеваний с помощью генотерапии, либо в опытах на животных разрабатываются подходы к такому лечению. По мере усовершенствования методов доставки генов и контроля их экспрессии список заболеваний, к которым можно применять генотерапию, будет безусловно расширяться.

Генотерапия применима не только к наследственным заболеваниям. Предстоит решить проблему лечения генами "чумы XX века" - синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), возникающего при заражении вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). ВИЧ представляет собой ретровирус, поражающий Т-лимфоциты и макрофаги. Болезнь удалось бы победить, если бы были найдены новые гены, введение которых в зараженные ВИЧ лимфоциты останавливало бы дальнейшее размножение вируса. Предложено множество хитроумных способов борьбы со СПИДом с помощью привнесенных генов. Все они основаны на новейших данных о строении и функционировании генома ретровируса. Например, вводя прямо в мышцы больного ретровирусные векторы, несущие отдельные гены ВИЧ, ученые рассчитывали на то, что гены ВИЧ после внедрения в ДНК хромосом хозяина смогут дать информацию для синтеза вирусных белков и произойдет "противоСПИДная" иммунизация больного этими белками. Однако еще не получено ощутимых результатов, которые сулили бы успех в борьбе с вирусом дикого типа, коварство которого заключается в его изменчивости.

Огромные перспективы открывает использование генотерапии для лечения онкологических заболеваний. Многолетние усилия ученых привели к пониманию того, что рак - это генетическое заболевание и его развитие происходит многостадийно, в результате серии генетических нарушений, накапливающихся в клетке. Следовательно, каждый из таких отдельных генетических эффектов может стать точкой приложения генотерапевтического подхода.

Получение трансгенных животных. Если вводить ДНК в клетки многоклеточного организма, то результатом трансформации будет изменение свойств лишь небольшого числа клеток, которые приобрели новый ген или гены. Следовательно, для изменения свойств всего организма следует изменять геном половых клеток, которые перенесут новые свойства потомкам. У растений и животных целесообразно изменять такие свойства, как скорость роста, устойчивость к заболеваниям, способность адаптироваться к новым внешним условиям. В качестве маркеров в этом случае можно использовать полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (AFLP), анализ мини-сателлитов, анализ микросателлитной ДНК (SSR), гибридизацию и т.д.

Разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений. От работы с довольно крупными яйцами амфибий перешли к изучению яйцеклеток и эмбрионов мыши, которая представляет наиболее изученное в генетическом отношении млекопитающее.

Микроинъекцию клонированных генов производят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. Чаще выбирают мужской пронуклеус, привнесенный сперматозоидом, так как его размеры больше. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной матери, или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку.

Можно вводить ген в сперматозоиды и затем проводить ими оплодотворение. Таким образом были инъецированы гены интерферона и инсулина человека, ген β-глобина кролика, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Число молекул, вводимое за одну инъекцию, колеблется от 100 до 300 000, а их размер - от 5 до 50 кб.

Выживает обычно 10 - 30% яйцеклеток, а доля мышей, родившихся из трансформированных яйцеклеток варьирует от нескольких до 40%. Таким образом, реальная эффективность составляет около 10%.

В 1981 году Константини и Лэси (Оксфорд) провели инъекцию в яйцеклетки мыши фрагменты хромосомной ДНК кролика длиной 19 килобаз. Эти фрагменты содержали ген β-глобина кролика. Яйцеклетки культивировали до стадии бластоцисты и имплантировали в матку. У 24 мышей, родившихся в результате развития имплантированных яйцеклеток, проведены частичная гепатоэктомия. Анализ ДНК из клеток печени показал, что у 9 мышей встречается от 1 до 20 копий на клетку гена β-глобина. После спаривания 4 трансформированных самцов с нормальными самками получили потомство из 18 животных. 6 из них также имели ген β-глобина. Установлено, что интеграция гена в клетки млекопитающих происходит случайным образом и не связана с конкретными областями хромосомы. Ген нестабилен, может быть утрачен или стать неактивным. Вместе с геном необходимо вводить регуляторные последовательности.

Метод введения генов в эмбриональные клетки имеет ограничения. Не всегда удается встроить чужеродную ДНК в заданный участок хромосомы. Разработанные методические примы пока не позволяют заменить имеющийся в геноме ген, вытесняя его, не всегда удается подчинить новый ген системе регуляции организма.

При трансгенозе могут возникать неожиданные проблемы. Например, одни из первых работ по генетической транформации животных проводились путем встраивания генов гормона роста. Перенос гена гормона роста крысы мышам увеличивал рост мышей в 2 раза. Эксперименты по трансгенозу генов гормона роста быка кроликам также увенчались успехом. А вот аналогичные эксперименты по модификации крупного рогатого скота привели к увеличению прироста всего на 10-20%. Очевидно, это связанно с тем, что у мышей сохраняется широкая норма реакции, и встраивание генов, увеличивающих количество гормона, заставляет генотип реализоваться максимально полно. У домашнего скота в результате направленной селекции организмы работают на верхнем пределе нормы реакции, отсюда ожидаемый эффект не проявился.

В нашей стране получены свиньи, несущие ген соматотропина. Они не отличались по темпам роста от нормальных животных, но изменение обмена веществ сказалось на содержании жира. Такие трансгенные свиньи были созданы для изучения цепочки биохимических превращений гормона, а побочным эффектом явилось укрепление иммунной системы.

В Англии созданы трансгенные овцы, молоко которых содержит фактор свертывания крови.

Также в нашей стране были попытки создать овец, продуцирующих химозин (фермент для сыроварения). Было получено 2 овцы, у одной - ген не экспрессировался, у второй содержание химозина достигало 300 мг/л. Однако потомство этой овцы давало низкие удои - порядка 50 кг за период лактации. Причина заключалась в том, что химозин вырабатывается в виде предшественника - прохимозина, который превращается в активный фермент при рН=5. Было запланировано получать именно прохимозин, но в каких-то участках вымени происходило снижение рН, что приводило к активации химозина непосредственно в организме. Активный химозин свертывал молоко, а оно закупоривало протоки вымени. Сейчас пытаются решить эту проблему.

В Подмосковье получены кролики, выделяющие γ-интерферон, эритропоэтин, но кролики не являются традиционными продуцентами молока. Эксперименты же по трансформации сельскохозяйственных животных очень дорогостоящи - одно трансгенное животное стоит десятки и сотни тысяч долларов.

Трансгенных животных получают и для целей ксенотрансплантации. Одним из излюбленных доноров органов являются свиньи, так как имеется анатомическое сходство органов и сходство иммунологических свойств. Реакции отторжения при трансплантации имеют сложный механизм. Одним из сигналов для атаки организма на чужой орган являются белки, локализованные на внешней поверхности мембраны. У трансгенных свиней эти белки заменены на человеческие.

Еще одно направление трансгеноза - получение устойчивых к болезням животных. Животноводство держится на вакцинах, так как селекция ведется преимущественно на хозяйственно ценные признаки - шерстистость, молочность и т. д. Повышение устойчивости - дело генных инженеров. К защитным белкам относятся интерфероны, поэтому ген интерферона встраивали различным животным. Трансгенные мыши получили устойчивость, они не болели или болели мало, а вот у свиней такого эффекта не обнаружено.

Трансгенных животных можно использовать для изучения наследственных заболеваний мозга и нервной системы. Гены болезни Альцгеймера (отложение белка β-амилоида приводит к образованию характерных бляшек) и гены, отвечающие за развитие эпилепсии, болезней мозга вводятся в геном нормальных животных; при этом получают трансгенных животных-моделей, на которых можно испытывать различные терапевтические приемы.

Трансгенных животных стали использовать для исследования воспалительных и иммунологических заболеваний человека, например, ревматоидного артрита. Моделируются болезни, связанные с липидным обменом.

2. Генетическое загрязнение планеты

генный инженерия наука

Необходимость обеспечения населения продовольствием, особенно в развивающихся странах, при заметном сокращении сельскохозяйственных площадей привела к переходу от экстенсивного к интенсивному ведению сельского хозяйства. Этот переход во многом привел, с одной стороны, к химизации последнего (ростом фирм, производящих удобрения, ядохимикаты и т.д.), а с другой - к возросшему селекционному отбору и, в частности, к переходу к активному использованию монокультур (например, при "зеленой революции").

Затем проходил процесс перехода от опасной химизации в сельском хозяйстве к повышению производительности естественно выращиваемых культур. Одновременно развитие биотехнологий привело в работе над генетических модифицированными организмами.

В настоящий момент доля экологически чистых(органических) продуктов в общем объеме продаж продуктов в США составляет 2%, 72%американских скпермаркетов имеет отделы экологически чистых продуктов.

По данным Datamonitor, в США спрос на органические продукты ежегодно растет в среднем на 16%, и, как считают эксперты рынка, к 2008 году объем этого рынка достигнет $26,6 млрд. О намерении расширять ассортимент экологически чистых продуктов уже заявили такие крупные пищевые корпорации, как Dole, General Mills, Dean Foods и Unilever. Европа несколько отстает от США по объемам продаж экологически чистых продуктов, однако и здесь этот рынок развивается достаточно активно. Наибольшим спросом такая продукция пользуется в Германии и Дании. Так, в Дании доля этих продуктов в общем объеме продаж даже выше, чем в США, и составляет 3%. Меньше всего экологическая продукция популярна во Франции: там ее доля в общем ассортименте- 0,5%.

Исследования "глубинных" составляющих материи привели к разработке и экономически выгодному применению биотехнологий, вплоть до генетически модифицированных организмов. Здесь речь идет о применении ГМ технологий для продовольственных и кормовых сельскохозяйственных культур, сельскохозяйственных сортов растений для получения лекарств (фармацевтические сельхозкультуры) и получения ГМ видов рыб.

Наряду с ГМ растениеводством идет обсуждение будущего ГМ видов рыб. Здесь мнения разделились. Одни считают, что у них нет будущего и эти виды рыбы и их потомство не выживут в эволюционном развитии и не окажут заметного влияния на естественные виды. Однако, другие полагают, что ГМ виды, которые создают ради их больших размеров, приведут к росту их потомства, но так как они менее приспособлены к выживанию, последует вымирание как естественных видов рыб, так и менее приспособленных к развитию ГМ рыб, что поставит под еще большую угрозу существование краснокнижных диких видов, например, лососевых.

Первые ГМ-сельскохозяйственные культуры были высажены на открытых полях в США в 1995 г. Это стало началом "генетического загрязнения" природы, которое сейчас приняло глобальные масштабы. Более того, ГМ пыльца этих культур, распространяемая ветром, насекомыми и человеком, стала "загрязнять" все вокруг на большие расстояния, оставляя лишь нетронутыми ничтожно малые территории тепличного сельского хозяйства. И все это, несмотря на все заявления сторонников ГМ технологий, что этого не случиться.

Иногда разделяют сельскохозяйственную отрасль экономики на два новых вида: промышленное сельское хозяйство, к которому относят ГМ сельское хозяйство и устойчивое - органическое - сельское хозяйство. Остается также традиционное сельскохозяйственное производство с использованием химических средств защиты растений и удобрений.

В качестве противодействия ГМ культурам 2 винодельческих графства в штате Калифорния запретили выращивание ГМ культур. Пивной американский гигант Anheuser- Busch Co. потребовал, чтобы ГМ-рисовые поля находились на расстоянии 120 миль от тех полей, которых являются источником риса для пивоварения. Европейский союз пытается установить буферные зоны, чтобы предотвратить распространение ГМ продуктов. Однако, такими мерами не удается сдержать распространение ГМ культур. Об этом свидетельствуют, например, заявления официальных лиц Австралии. В этом нет ничего удивительного для тех, кто занимается распространением загрязнителей воздуха на большие расстояния. В 1979 г. была подписана специальная международная конвенция по этому вопросу. В то же время в Европе после запрета на испытания ГМ растений, принятого в 1998 г., страны начинают разрешать некоторые формы ГМ культур.

Следует отметить, что в выигрыше в этой ситуации оказываются компании, которые производят ГМ семена урожайных культур, такие как "Монсанто", "Доу кемикалс" и "Новартис". Фермеры заплатили за ГМ культуры 2,2 млрд. долл. США в 2004 г., на 1 млрд. долл. больше, чем в 2001 г. Наиболее широко распространены ГМ культуры соевых бобов, а также хлопка и кукурузы. Засеянные ГМ культурами площади возросли в 2004 г. на 20% и занимают 200 млн. акров в 17 странах мира. Когда такие, генетически загрязненные, культуры получат широкое распространение, компании, которые запатентовали ГМ семена, смогут потребовать выплат за их "незаконное" использование как попрание своих прав на интеллектуальную собственность. В 2004 г. фирма "Монсанто" выиграла в США длившийся семь лет судебный иск 73-летнему фермеру, который незаконно выращивал на своем поле культуры, запатентованные этой фирмой. В то же время раздаются обвинения в адрес фермеров, выращивающих ГМ сельскохозяйственные культуры, которые должны быть ответственны за распространение генетического загрязнения. Всемирная торговая организация, которая активно занимается вопросами защиты интеллектуальных прав собственности, находится на стороне таких крупных рыночных гигантов и аналогичные разбирательства происходят, как правило, секретно. В 2005 году стало ясно, что ГМ культуры не принесли обещанных компаниями гигантских прибылей ни фермерам, ни потребителям. Министерство сельского хозяйства США не применило установленных им же жестких ограничений в отношении предотвращения случайного распространения (загрязнения) пыльцы ГМ растений на соседние поля. Обещания больших выгод ГМ культур для здоровья населения также оказались преувеличенными. Предполагалось, что ГМ культуры приведут к отказу от использования опасных пестицидов.

Первые ГМ растения вырабатывали собственные пестициды и были устойчивы против гербицидов, что создавало возможность фермерам распылять гербициды и не вредить своим культурам. Ученые сейчас разрабатывают сельскохозяйственные растения, требующие меньше воды и удобрений, т.е. менее зависимые от состояния окружающей среды. Получилось все наоборот. Первые ГМ сорта растений компании «Монсанто» были созданы таким образом, чтобы они не впитывали в себя ее самое прибыльное и запатентованное средство против сорняков -«Раунд-ап». Поэтому фермеры стали покупать еще больше этого химиката. Таким образом, наибольшие прибыли получили компании, производящие семена, которые затем загрязняют планету «патентованной» пыльцой. Существует опасение, что человечество, будущие его поколения, станут заложниками нескольких корпораций, которые будут иметь юридические права на снабжение продовольствием и на стороне которых будут выступать суды. Европейским и американским фермерам, занимающимся органическим земледелием приходится закупать семена в далеких от них странах, например, в Китае с тем, чтобы обеспечить их "генетическую чистоту".

Датское правительство приняло закон, цель которого замедлить распространение генетического загрязнения. Фермеры, чьи поля оказались генетически загрязненными, получат компенсацию от тех фермеров, которые используют ГМ семена. Естественно, что такой закон не решает полностью возникшую проблему.

В этой ситуации особое внимание обращается на сельскохозяйственные биотехнологии для ГМ урожайных культур для производства лекарств и промышленных химикатов.

Литература

1.Биологическое загрязнение / Экология, 1992, № 2.- С. 12-15.

2.Боровский Ю.В., Галиев Р.Ф. Бактериологическое оружие вероятного противника и защита от него. М. 1990

3.Знание-сила (научно-популярный журнал) Статьи о клонированни:1998, № 4; 2000, № 4, 5, 7.- С.72-75.

4.Конов А.Л. Биотехнология и ГПГ / Экология и жизнь. 2002, № 2. - С.65-68.

5.Копия для президента или чего нам ждать от генной инженерии /Медицинская газета. 2001, №7.- С.6.